实验目的
- 在避免生物危险的虚拟仿真环境中达到以下学习目的：
- 1.通过虚拟演示和人机互动巩固理论知识，掌握结核分枝杆菌的检查方法、形态特征、报告方式和结果解释。
- 2.通过虚实结合方式培养实际动手能力，掌握实验室生物安全个人防护措施和结核分枝杆菌的微生物学特征，包括结核分枝杆菌的镜下特征、培养形态学和鉴定方法等。
- 3.通过开放实验体系培养综合创新思维，熟悉虚拟项目中开放实验设计，登录真实网站进行科学探索。
实验原理
- 结核分枝杆菌是结核病的病原体，检测患者标本中的结核分枝杆菌可为临床诊断结核病提供“金标准”。
- 1.临床角度，虚拟临床问诊情景：进入虚拟实验后以点击的方式了解结核病的分类、临床特征，并检索相应的实验室检查项目和对应标本，包括痰液、尿液、脑脊液、胸水、腹水、病灶组织、胃液标本、大便等标本。
- 2.虚拟实验操作，避免生物危害：包括形态学观察、分离培养、重要鉴定试验、特殊鉴定试验和药敏试验。①形态学观察，包括抗酸染色、金胺“O”荧光染色；②分离培养，包括标本处理、接种培养和连续观察。③药敏试验，如氧化还原试验。④扩展试验包括分子PCR和测序鉴定试验、多位点数量可变串联重复序列分析（multiple loci VNTR analysis，MLVA）试验和耐药基因检测试验。
- 3.生物防护操作，培养生物安全意识：掌握实验室安全设备和个人防护用品的使用。
知识点
1.结核感染临床诊断
结核病由结核分枝杆菌导致。通常感染并破坏肺以及淋巴系统，但其它器官如脑、中枢神经系统、循环系统、泌尿系统、骨骼、关节、甚至皮肤亦可受感染。结核分枝杆菌可引起多种脏器组织的结核病，其中以肺结核为多见。该菌初次感染在肺内形成病灶，称为原发性感染。机体免疫力低下时,原发感染灶恶化，结核分枝杆菌经气管淋巴道或血流播散，形成全身性粟粒性结核。当机体抵抗力强时，使感染灶形成结核结节，淋巴结病灶逐渐纤维化和钙化，不治自愈。但病灶内常有一定量的细菌长期潜伏，不断刺激机体产生免疫，也可成为以后内源性感染的来源。结核病的临床症状包括全身症状和局部症状。
2.实验室安全设备和个人防护措施
实验室安全设备包括生物安全柜的使用要点。工作人员进行结核分枝杆菌培养操作时，应穿戴以下个人防护用品：专用隔离衣（倒背衣）；戴N95 口罩；帽子；乳胶医用手套。
3.结核感染送检要点
根据感染部位的不同，采集不同的标本。结核患者各感染部位的标本中大多数混有其他细菌，为此必须采取适宜并能抑制污染菌的方法。如取来自患者的肺部痰，最好收集清晨第一口痰，盛清洁干燥的容器内送检。尿液收集应取清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10-15ml送检，必要时作无菌导尿送检。诊断泌尿道结核通常需3-5份标本。采集胃液可于空腹时抽取胃液或洗胃液(特别是儿童)置无菌瓶中送检。无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等置无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养。采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物。深部脓肿用无菌注射器抽取，置无菌试管送检。棉拭采集的标本应直接放置肉汤中培养。
4.抗酸染色检测方法
初染：将已固定的涂片置于染色架上或用染色夹子夹住，滴加石炭酸复红染色液，盖满菌膜。小心弱火加热至出现蒸汽后，脱离火焰，染色期间应始终保持菌膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。切勿使染色液沸腾或煮干，保持染色5分钟，然后用流水目玻片上端轻洗，洗去染色液。脱色：自涂片部位上端外缘滴加脱色液(3%盐酸酒精)，流过涂片部位，约1分钟。脱色应单片进行。然后用流水自玻片上端轻洗，去脱色液。复染：滴加吕氏美蓝复染液，染色1分钟，然后用流水自玻片上端轻洗，去复染液。印干后镜检(印干用的滤纸只能使用一次,以防出现假阳性结果)。
5.金胺“O”荧光染色检测方法
荧光染色：于已固定的涂片滴加荧光染液金胺“O”，染色10-15分钟，然后用流水自玻片上端轻洗，洗去染色液。脱色：自涂片部位上端外缘滴加脱色液(0.5%盐酸酒精)，流过涂片部位3-5分钟，需脱至涂片部位无黄色为止，然后用流水自玻片上端轻洗，去脱色液。复染：0.5%高锰酸钾复染2分钟，然后用流水自玻片背面上端轻洗，去复染液。待干后用荧光显微镜高倍镜检查
6.结核菌培养检测操作
标本预处理（碱处理法）：视痰标本性状，加入40g/LNaOH溶液2-4倍量混匀后，置室温30分钟，此期间振荡痰液2-3次，使痰充分匀质化，待接种。
接种培养：用无菌吸管取处理后的标本0.1ml，均匀接种在整个L-J培养基斜面，每份标本接种2支L-J培养基。接种后斜面向上，于37℃环境中平放24小时后(使标本分布均匀)，检查培养基的污染情况，拧紧瓶盖，直立放置，37℃继续培养至第八周。
连续观察：接种后第三、五、七天各观察一次菌落生长情况，此后每周观察一次，记录菌落生长及污染情况，注意菌落形态、数量、色泽变化和出现菌落的时间。结核分枝杆菌在L-J培养基斜面上菌落为干燥、粗糙、颗粒状、乳白色或米黄色、凸起、形似花菜心或粟米粒。培养阴性结果须在满8周后未见菌落生长者方可报告。
7.结核分枝杆菌药敏试验（氧化还原指示剂法）
制备麦氏标准1号管浊度的菌悬液，吸取1麦氏菌悬液0.2 mL，加到培养液瓶中，充分混匀；打开药敏测试板板盖，用无菌吸管吸取 0.5 mL 混有菌悬液的培养液至质控孔及各个反应孔，盖上板盖，并将试板放入透明自封袋中密封，放置于37℃培养；培养6d后，自第7天始，每日观察质控孔，当质控孔出现白色沉淀颗粒后，于每孔分别添加12μL显色剂A和25μL显色剂B，37℃继续培养至24h判读结果。
8.结核病的分子检测试验
多聚酶链反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，包括选择PCR体系和条件，操作中避免出现假阳性。PCR产物结果以虚拟电泳和虚拟测序结果展示。实际操作部分：测序完成得到一段DNA序列，需要学生自行粘贴到美国NCBI的GenBank数据中进行比对，以得到鉴定结果。